توليد انگل تراريخته ژنتيكي ليشمانيا اينفانتوم بيان كننده ژن پروتئين فلورسنت سبز

خلاصه در پرونده يافت نشد به تصوير شرح و توصيف مراجعه شود.

انگل ليشمانيا يوكاريوتي تك سلولي مي باشد كه عامل بيماري ليشمانيوز است. ليشمانيوز مجموعه اي از بيماريهاي انگلي وابسته به ناقل با يك طيف وسيعي از علائم باليني است كه طي آن فاگوسيت هاي تك هسته اي مورد هدف قرار مي گيرند و در نتيجه بقاي انگل درون سلولهاي ماكروفاژ ، كارائي اين سلولها را از بين مي برد. در بررسي هاي تحقيقاتي شيوه هاي مختلفي براي اندازه گيري عفونت ليشمانيا در بافت حيوانات يا در ماكروفاژهاي آلوده بصورت in vitro استفاده مي گردد (نظير مشاهده فرم آماستيگوت انگل با رنگ آميزي گيمسا) كه روشهاي دشوار و وقتگير هستند. اما امروزه استفاده از انگلهاي تراريخت شده بيان كننده ژن هاي گزارشگر براي مشاهده و رديابي سريع و آسان انگلها در بافت يا سلول آلوده در شرايط in vitro و in vivo رايج شده است. ژنهاي گزارشگر ژنهايي هستند كه فنوتيپ قابل سنجش ايجاد مي كنند و به راحتي در بين پروتئين هاي اندوژن قابل تشخيص مي باشند. ژن پروتئين فلورسنت سبز GFP يك پروتئين اتوفلورسنت است و نيازي به سوبسترا ندارد. از ديگر مزيتهاي GFP بر ديگر ژنهاي گزارشگر، سميت پائين، بيان پايدار و آسان و سريع و ارزانتر بودن آن است. پروتئين EGFP شكل جهش يافته GFP تيپ وحشي است كه فلورسنت آن در طول موج هاي بالاتر قابل رؤيت مي باشد و به سلول زنده آسيب وارد نمي كند. در اين طرح، براي نخستين بار در ايران، پلاسميد بياتي خطي شده PLEXSY حاوي EGFP را از طريق نوتركيبي مشابه در لوكوس rRNA S 18كروموزومي انگل ليشمانيا ماژور الحاق (ترانسفكشن پايداري نموديم بطوريكه بيان اين ژن تحت كنترل پروموتر RNA پليمراز قرار گيرد. تائيد ژن فلورسنت در اين انگل توسط ميكروسكوپ فلورسنت و تكنيك وسترن بلات با استفاده از آنتي بادي ضد GFP مورد تأييد قرار گرفت

باكتري لاكتوكوكوس لاكتيس يك كانديد مناسب براي بيان و توليد پروتئين مي باشد. علاوه بر آن، بدليل غيرپاتوژن بودن و داراي ديواه سلولي، براي بيان پروتئينهاي نوتركيب بر سطح ديواره و عرضه آن به سيستم ايمني و نيز استفاده از آن در بافتهاي مخاطي بسيار مورد توجه است و در صنايع غذايي و پزشكي كاربرد فراواني دارد. براي بيان پروتئين نوتركيب بر سطح ديواره، ژن مورد نظر در وكتور پلاسميدي مناسب و در پايين دست يك سيگنال پپتيد كلون مي گردد. در مراحل بيان و توليد اين باكتري نوتركيب، بايد از قرار گيري پروتئين نوتركيب اطمينان حاصل شود. در روشهاي رايج معمولاً از ليزات كل باكتري براي تأييد پروتئين بيان شده در سلول استفاده مي شود. اما براي تأييد بيان پروتئين و قرارگيري آن بر سطح ديواره باكتري، بايد اجزاء سلول بصورت فركشنهاي مختلف از هم جدا شوند و با استفاده از روشهايي مانند وسترن بلات مورد بررسي قرار گيرند. شرايط استفاده از روشهاي معرفي شده براي تهيه فركشن ديواره سلول در هر آزمايشگاهي مقدور نيست. در اينجا با اعمال تغييراتي در روشهاي اجرا به شيوه اي ساده تر و مقرون به صرفه تر دست پيدا كرديم و براي جداسازي ديواره سلول باكتري لاكتوكوكوس لاكتيس بكار برديم.

بيماري ليشمانيوز نوعي عفونت انگلي بين انسان و حيوان است و يكي از بيماري هاي شايع در ايران و بسياري از كشورهاي جهان به شمار مي آيد، كه هنوز راه درمان قطعي و يا واكسن مؤثري براي آن شناخته نشده است. يكي از دلايل عدم موفقيت در اين زمينه فقدان يك آزمون حساس و دقيق براي شناسايي انگل در درون سلول يا جيوان مورد مطالعه است. امروزه با استفاده از تكنولو‍ژي ترانس فكشن و به كمك ژنهاي گزارشگر مي توان به شيوه هاي سريع، حساس و مؤثر براي بررسي اثر تركيبات ضد ليشمانيايي و يافتن داروهاي جديد و مطالعات آنها دست يافت. با الحاق ژنهاي EGFP-LUC در لوكوس 18SrRNA ژنوم انگل ليشمانيا ماژور، انگلهاي توليد شده اند كه فنوتيپ قابل اندازه گيري فلورسنت و لومينوسنت توليد مي كنند. به كمك اين انگلها مي توان سير عفونت در موش را رديابي و حيات و بار انگلي در درون سلول يا بافت را تخمين زد